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細菌培養(yǎng)

發(fā)布時間:2021-04-09 17:38:29

(一) 病料采集和運送 對動物進行病原菌檢疫,病料的采集和運送是否得當,是關系到能否分離到病原菌的關鍵。首先充分了解各種病原菌(目的菌)在被檢動物體內(nèi)及其分泌物和排泄物中的分布情況,不同的病原菌在患病動物體內(nèi)分布情況不同,即使是同一種病原菌,在病的不同時期和不同的病型中分布也不同。在采取病料前必須對被檢動物可能患有何種疫病作出初步診斷。采取病料所用器械和宣傳品器都應事先消毒,確保無毒,采樣時應無菌操作。如果動物已死亡,取樣應注意以下幾點:⑴ 對急性死亡的動物,從耳尖或四肢末梢血管取血制成涂片,染色鏡檢,在排除炭疽后方能剖檢取樣;⑵ 采取病料時間,原則是越早越好,夏季要在動物死亡后2小時內(nèi)采取病料;⑶ 為了提高病原微生物的陽性分離率,采取的病料要盡量可能齊全,除了內(nèi)臟、淋巴結和局部病變組織外,還應采取腦組織和骨髓,以防遺漏;⑷ 認真填寫好病料送檢單和剖檢病理變化記錄。下面介紹病料的采取方法。


1. 膿汁 先將表面流水線,然后以滅菌注射器或吸管抽取深部的濃汁;若是開口化膿灶或皮膚、粘膜表面化膿,可用滅菌棉拭子浸沾膿汁后,放入試管中。


2. 內(nèi)臟器官 采取心、肺、肝、脾、腎等有病變的組織及其淋巴結,無病變時也要采取,無菌剪取1-2cm大的方塊,分別裝入滅菌容器內(nèi)。


3. 血液 要全血時,無菌采取血液10m,立即注入盛有含0.5%肝素溶液0.1ml或5%檸檬酸鈉液1ml的滅菌試管內(nèi),并立即混合均勻。要分離血清時,將無菌采取的血液直接注入滅菌試管,待血液自然凝固后分離血清。從尸體采取血液時,可用滅菌注射器或吸管從右心房抽取。


4. 皮膚和粘膜 采取病變局部的皮膚和粘膜及其所屬淋巴結,放入甘油鹽水溶液中。


5. 腦和脊髓 無菌采取腦的脊髓約1-2cm大的方塊,放入甘油鹽水溶液中。


6. 膽汁 用滅菌注射器抽出后放入滅菌試管中。


7. 腸和胃 剪取有病變的部位一段或一塊。也可將腸管一段(約6-8cm)用線扎緊兩端后剪下送往實驗室。


8. 糞便 可用棉拭子插入肛門沾取,或撲殺病畜后由腸管采取,立即放低溫條件下保存。


9. 乳汁 先用消毒藥液洗凈乳頭及其附近,棄去最初擠出的幾滴乳汁,然后采取乳汁約10ml放入滅菌試管內(nèi)。


10. 流產(chǎn)胎兒 可將整個胎兒用塑料薄膜包緊,裝入箱中送檢。


11. 小動物、禽和魚等可按上述流產(chǎn)胎兒方式整體送檢。在距離實驗室很近,又有隔離運輸條件時,也可將發(fā)病小動物直接送檢。


(二) 病料的處理 采集的病料,在接種培養(yǎng)前,應對其性狀進行觀察,例如:是否膿性帶血或腐敗,有何異味,并作記錄。各種病料在分離培養(yǎng)前均應制備一張涂片,作革蘭氏染色、鏡檢,以了解細菌的形態(tài)、染色特性,并大致估計其含菌量。通過肉眼觀察和顯微鏡下看到的結果,對病料中可能含有的病原菌作最初步的估價。


如果病料是病變組織,又是用無菌方法采集的,在接種前一般無需作特別處理。但如果病料被雜菌污染嚴重,則需根據(jù)要分離的病原菌的特性,采用一些對病原菌無害,但對雜菌有殺滅或抑制作用的方法,以抑制雜菌生長。例如從糞便中分離沙門氏桿菌,可將糞合接種于亞硒酸鈉肉湯中,作增菌處理。在這種培養(yǎng)基中,其它雜菌被抑制,而沙門氏桿菌則能自由繁殖。又如,分離布魯氏桿菌、胎兒彎曲桿菌、炭疽桿菌、副結核桿菌可用選擇性抗菌瓊脂。分離鏈球菌和豬丹毒桿菌用疊氮鈉結晶紫血瓊脂等。如果從腸道內(nèi)容物或從污染有不產(chǎn)生芽胞的雜菌培養(yǎng)物中分離能形成芽胞的細菌(如魏氏梭菌、破傷風梭菌等),可將病料在80℃加熱15分鐘,以殺死不形成芽胞的雜菌,取此材料再接種培養(yǎng)基,即容易獲得純培養(yǎng)物。有些病料(如奶、尿等)含菌太少,則應先作集菌處理,然后接種,以提高檢出率,其集菌方法有離心法和過濾法。離心法取沉淀物作培養(yǎng)物;過濾后取沉積于濾板上表面的病料作培養(yǎng)。還有些細菌往往在細胞漿內(nèi)集結成團,在它們所形成的病灶中含菌較少,遇到這種情況,可將病料組織磨碎,制成乳劑,加入酶、酸或堿,消化組織,使菌團散開,然后離心,收集沉淀物作培養(yǎng)(如從腸粘膜分離副結核桿菌即用此法)。


(三) 細菌的分離與接種 培養(yǎng)細菌時,須將標本或細菌培養(yǎng)物接種于培養(yǎng)基上,常用接種方法有以下幾種。


1. 平板劃線接種法 本法為最常用的分離培養(yǎng)細菌的方法,通過平板劃線后,可使細菌分散生長,形成單個菌落,有利于從含有多種細菌的標本中分離出目的菌。分離培養(yǎng)用的平板培養(yǎng)基應表面干燥,可于臨用前置37℃孵育箱內(nèi)30分鐘,這樣表面即干燥有利于分離培養(yǎng),又使培養(yǎng)基預溫,對培養(yǎng)某些較嬌弱的細菌有利。常用的平板劃線接種法有以下幾種。


(1) 分區(qū)劃線法 此法多用于膿汁、糞便等含菌量較多的標本的分離。其方法是首先將接種環(huán)滅菌后,沾取標本均勻涂布于平板培養(yǎng)基邊緣一小部分(第一區(qū)),將接種環(huán)火焰滅菌,待冷卻后只通過第一區(qū)3-4次后連續(xù)劃線(為第二區(qū)),依次可共劃線3-5區(qū),每一區(qū)細菌數(shù)可逐漸減少,直到分離出單個菌落為止。


(2) 連續(xù)劃線法 該法多用于含菌數(shù)量較少的標本。其方法是首先用白金耳將標本均勻涂布于平板培養(yǎng)基邊緣一小部分,然后由此開始,在培養(yǎng)基表面自左向右連續(xù)劃線并逐漸向下移動,直到下邊緣。


劃線接種時,盡可能作到直、密、勻,有效地利用培養(yǎng)基表面達到充分分離的目的。如果標本含菌較多,接種在強選擇培養(yǎng)基(如SS瓊脂)上時或標本含菌較少時,采用分區(qū)劃線法接種,接種環(huán)可一直劃完各區(qū)皿內(nèi),中間不必滅菌。


2. 斜面接種法 采用該法目的是進行純培養(yǎng)。其方法是從平板分離培養(yǎng)物上用接種環(huán)挑取單個菌落或者是取純種,移種至斜面培養(yǎng)基上,先從斜面底部自下而上劃一條直線,再從底部開始向上劃曲線接種,盡可能密而勻,或者直接自下而上劃曲線接種。


3. 傾注培養(yǎng)法 此法適用于乳汁和尿液等液體標本的細菌計數(shù)。其方法是取原標本或經(jīng)適當稀釋(一般是10-1 -10-5倍稀釋)的標本1ml,置于直徑9cm無菌平皿內(nèi),傾入已融化并冷至50℃左右的培養(yǎng)基約15ml,立即混勻待凝固后倒置于37℃培養(yǎng)18-24小時,做菌落計數(shù)。


4. 穿刺接種法 本法多用于雙糖、明膠等具有高層的培養(yǎng)基進行接種。方法是用接種針挑取菌落或培養(yǎng)物,由培養(yǎng)基中央直刺到距管底約0.3-0.5cm處。然后沿穿刺線退出接種針,若為雙糖等含高層斜面的培養(yǎng)基則光穿刺高層部分,退出接種針后直接曲線接種斜面部分。


5. 液體接種法 本法多用于普通肉湯,蛋白胨、水等液體培養(yǎng)基的接種。其方法是接種環(huán)沾取菌種,傾斜液體培養(yǎng)基管,先在液面與管壁交界處研磨接種物(以試管直立后液體能淹沒接種物為準),然后再在液體中擺動2-3次接種環(huán),塞好棉塞后輕輕混合即可。


(四) 細菌的培養(yǎng)方法 根據(jù)培養(yǎng)細菌的目的和培養(yǎng)物的特性培養(yǎng)方法分為一般培養(yǎng)法、二氧化碳培養(yǎng)法和厭氧培養(yǎng)法三種。


1. 一般培養(yǎng)法 將已接種過的培養(yǎng)基,置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)18-24小時,需氧菌和兼性厭氧菌即可于培養(yǎng)基上生長。少數(shù)生長緩慢的細菌,需培養(yǎng)3-7天直至一個月才能生長。為使培養(yǎng)箱內(nèi)保持一定濕度,可在其內(nèi)放置一杯水。培養(yǎng)時間較長的培養(yǎng)基,接種后應將試管口塞棉塞后用石臘凡士林封固,以防培養(yǎng)基干裂。


2. 二氧化碳培養(yǎng)法 某些細菌,如牛流產(chǎn)布氏桿菌和胎兒弧菌等需要在含有10%二氧化碳的空氣中才能生長,尤其是初代分離培養(yǎng)要求更為嚴格。將已接種的培養(yǎng)基置于二氧化碳環(huán)境中進行培養(yǎng)的方法即二氧化碳培養(yǎng)法,常用方法有以下幾種:


(1) 二氧化碳培養(yǎng)箱 可將已接種的培養(yǎng)基直接放入箱內(nèi)孵育,即可獲得二氧化碳環(huán)境。


(2) 燭缸法 將已接種的培養(yǎng)基,置于容量為2 000ml的磨口標本缸或干燥器內(nèi)。缸蓋或缸口處均需涂以凡士林,然后點燃蠟燭直立置入缸中,密封缸蓋。待燃自行熄滅時,容器內(nèi)約含5-10%的CO2 容器置37℃培養(yǎng)。


(3) 重碳酸鈉-鹽酸法 每升容積的容器內(nèi),重碳酸鈉與鹽酸按0.4g與3.5ml的比例,分別將兩種藥各置一器皿內(nèi)(如平皿內(nèi)),連同器皿置于標本缸或干燥器內(nèi),蓋嚴后使容器傾斜,兩種藥品接觸后即可產(chǎn)生二氧化碳。


3. 厭氧培養(yǎng)法 目前常用的厭氧培養(yǎng)方法有厭氧罐法、氣袋法及厭氧箱三種。


(1) 厭氧罐法 是目前應用較廣泛的一種方法,共分為以下幾種。


抽氣換氣法:該法適用于一般實驗室,其特點是較經(jīng)濟并可迅速建立厭氧環(huán)境。標本接種后,將平板放入?yún)捬豕?,擰緊蓋子,用真空泵抽出罐中空氣,使壓力真空表至-79.98KPa,停止抽氣,充入高純氮氣使壓力真空表指針回0位,連續(xù)反復3次,最后在罐內(nèi)-79.98KPa的情況下,充入70%的N2 、20%H2 、10%CO2 (有人改用20%CO2 及80%H2 ,亦可獲得好結果)。罐中需放入冷催化劑鈀粒,可催化罐中殘余的O2 和H2 化合成水。同時罐中應放有美藍指示管,美藍在有氧的環(huán)境下呈藍色,無氧時為紅色。臨用前首先將美藍煮沸使變成無色,放入罐中先呈淺藍色,待罐中無氧環(huán)境形成,美藍即可持續(xù)無色。


氣體發(fā)生袋法:氣體發(fā)生袋系由錫箔密封包裝,其中含有兩種藥片,一種為含枸椽酸和重碳酸氫鈉的藥片,另一種是含有硼氫化鈉的藥片。前者遇水放出二氧化碳,后者可釋放氫。使用時在袋的右上角剪一小口,灌進10ml蒸餾水,立即放入含有鈀粒、指示劑及平板培養(yǎng)基的厭氧罐中,擰緊蓋子經(jīng)2-3分鐘后,可感到蓋子微熱并有少量水蒸氣出現(xiàn)。密封后1小時左右罐中的O2 的含量可低于<1%。


(2) 氣袋法 此種方法不需要特殊設備,操作簡單,使用方便,不但實驗室中可用,而且外出采樣、現(xiàn)場接種也可用。原理與氣體發(fā)生袋完全相同,只是采用塑料袋代替了厭氧罐,氣袋為一透明而密閉的塑料袋,內(nèi)裝有氣體發(fā)生安瓿、指示劑安瓿、含有催化劑的帶孔塑料管各一支。其操作方法為首先將接種的平板培養(yǎng)基放入袋中,用彈簧夾夾緊袋口,然后用手指壓碎氣體安瓿,20分鐘后再壓碎指示劑安瓿,如果指示劑不變藍色,說明袋內(nèi)達到厭氧狀態(tài),即可放入37℃進行培養(yǎng)。


(3) 厭氧培養(yǎng)箱 使用之前須仔細檢查厭氧裝備有無漏氣等問題,以及催化劑、指示劑質量等。使用時嚴格遵守操作規(guī)程,保證箱內(nèi)氣體比例合理。




細胞培養(yǎng)常見問題及其解決


1. 如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基?




培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長??傊?,首選MEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始。


2. 何時須更換培養(yǎng)基?


視細胞生長密度而定, 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間,按時更換培養(yǎng)基即可。


3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基?


不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養(yǎng)基,若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基, 細胞大都無法立即適應, 造成細胞無法存活。


4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類?


不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源,所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。


5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?


FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯誤的使用字眼, 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。


6 培養(yǎng)細胞時應使用5 % 或10% CO2?或根本沒有影響?


一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng), 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2 濃度。當培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,細胞培養(yǎng)時應使用10 % CO2;當培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時, 則應使用5 % CO2 培養(yǎng)細胞。


7.Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么?Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別?


HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。


8. 細胞之接種密度為何?


依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。


9. 懸浮性細胞應如何繼代處理?


一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中, 稀釋細胞濃度即可,若培養(yǎng)液太多時, 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高, 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶, 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度, 重復前述步驟即可。


10.冷凍管應如何解凍?


取出冷凍管后, 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍, 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化, 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時, 必須注意安全, 預防冷凍管之爆裂。


11. 細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時, 是否應馬上去除DMSO?


除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細胞外, 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞), 在解凍之后, 應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中,待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。


12. 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?


一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于–20 °C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低,并可減少污染之機會。


13.欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?


欲回收動物細胞, 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),5 - 10 分鐘, 過高之轉速, 將造成細胞死亡。


14. 細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何?


動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能, 故不可將DMSO 直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。


15.DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何?


冷凍保存使用之DMSO 等級, 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即為無菌狀況, 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于4°C,避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質, 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO, 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。


16.冷凍保存細胞之方法?


冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。


冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時, 以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。


17. 細胞欲冷凍保存時, 細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度?


冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。


18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素?


除于特殊篩選系統(tǒng)中外, 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下, 培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。


19.應如何避免細胞污染?


細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環(huán)境、與品質良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。


20.如果細胞發(fā)生微生物污染時,應如何處理?


原則上:直接滅菌后丟棄之。


當重要的培養(yǎng)污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。


1.在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞,稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。


2.分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi),把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。


3.每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現(xiàn)空泡,匯合度下降和變圓。


4.確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2~3代。


5.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。


6.重復步驟4。


7.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4~6代,確定污染是否以已被消除。


21.支原體(mycoplasma) 污染的細胞,是否能以肉眼觀察出異狀?


不能。除極有經(jīng)驗之專家外,大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株,無法以其外觀分辨之。


22.支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響?


支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù), 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結果之數(shù)據(jù)方有意義。


23. 偵測出細胞株有支原體污染時, 該如何處理?


直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。


24. CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔?


定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去

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