你好,歡迎訪(fǎng)問(wèn)鄭州九龍生物制品有限公司官方網(wǎng)站!
全國咨詢(xún)熱線(xiàn):4009937078

細菌培養

發(fā)布時(shí)間:2021-04-09 17:38:29

(一) 病料采集和運送 對動(dòng)物進(jìn)行病原菌檢疫,病料的采集和運送是否得當,是關(guān)系到能否分離到病原菌的關(guān)鍵。首先充分了解各種病原菌(目的菌)在被檢動(dòng)物體內及其分泌物和排泄物中的分布情況,不同的病原菌在患病動(dòng)物體內分布情況不同,即使是同一種病原菌,在病的不同時(shí)期和不同的病型中分布也不同。在采取病料前必須對被檢動(dòng)物可能患有何種疫病作出初步診斷。采取病料所用器械和宣傳品器都應事先消毒,確保無(wú)毒,采樣時(shí)應無(wú)菌操作。如果動(dòng)物已死亡,取樣應注意以下幾點(diǎn):⑴ 對急性死亡的動(dòng)物,從耳尖或四肢末梢血管取血制成涂片,染色鏡檢,在排除炭疽后方能剖檢取樣;⑵ 采取病料時(shí)間,原則是越早越好,夏季要在動(dòng)物死亡后2小時(shí)內采取病料;⑶ 為了提高病原微生物的陽(yáng)性分離率,采取的病料要盡量可能齊全,除了內臟、淋巴結和局部病變組織外,還應采取腦組織和骨髓,以防遺漏;⑷ 認真填寫(xiě)好病料送檢單和剖檢病理變化記錄。下面介紹病料的采取方法。


1. 膿汁 先將表面流水線(xiàn),然后以滅菌注射器或吸管抽取深部的濃汁;若是開(kāi)口化膿灶或皮膚、粘膜表面化膿,可用滅菌棉拭子浸沾膿汁后,放入試管中。


2. 內臟器官 采取心、肺、肝、脾、腎等有病變的組織及其淋巴結,無(wú)病變時(shí)也要采取,無(wú)菌剪取1-2cm大的方塊,分別裝入滅菌容器內。


3. 血液 要全血時(shí),無(wú)菌采取血液10m,立即注入盛有含0.5%肝素溶液0.1ml或5%檸檬酸鈉液1ml的滅菌試管內,并立即混合均勻。要分離血清時(shí),將無(wú)菌采取的血液直接注入滅菌試管,待血液自然凝固后分離血清。從尸體采取血液時(shí),可用滅菌注射器或吸管從右心房抽取。


4. 皮膚和粘膜 采取病變局部的皮膚和粘膜及其所屬淋巴結,放入甘油鹽水溶液中。


5. 腦和脊髓 無(wú)菌采取腦的脊髓約1-2cm大的方塊,放入甘油鹽水溶液中。


6. 膽汁 用滅菌注射器抽出后放入滅菌試管中。


7. 腸和胃 剪取有病變的部位一段或一塊。也可將腸管一段(約6-8cm)用線(xiàn)扎緊兩端后剪下送往實(shí)驗室。


8. 糞便 可用棉拭子插入肛門(mén)沾取,或撲殺病畜后由腸管采取,立即放低溫條件下保存。


9. 乳汁 先用消毒藥液洗凈乳頭及其附近,棄去最初擠出的幾滴乳汁,然后采取乳汁約10ml放入滅菌試管內。


10. 流產(chǎn)胎兒 可將整個(gè)胎兒用塑料薄膜包緊,裝入箱中送檢。


11. 小動(dòng)物、禽和魚(yú)等可按上述流產(chǎn)胎兒方式整體送檢。在距離實(shí)驗室很近,又有隔離運輸條件時(shí),也可將發(fā)病小動(dòng)物直接送檢。


(二) 病料的處理 采集的病料,在接種培養前,應對其性狀進(jìn)行觀(guān)察,例如:是否膿性帶血或腐敗,有何異味,并作記錄。各種病料在分離培養前均應制備一張涂片,作革蘭氏染色、鏡檢,以了解細菌的形態(tài)、染色特性,并大致估計其含菌量。通過(guò)肉眼觀(guān)察和顯微鏡下看到的結果,對病料中可能含有的病原菌作最初步的估價(jià)。


如果病料是病變組織,又是用無(wú)菌方法采集的,在接種前一般無(wú)需作特別處理。但如果病料被雜菌污染嚴重,則需根據要分離的病原菌的特性,采用一些對病原菌無(wú)害,但對雜菌有殺滅或抑制作用的方法,以抑制雜菌生長(cháng)。例如從糞便中分離沙門(mén)氏桿菌,可將糞合接種于亞硒酸鈉肉湯中,作增菌處理。在這種培養基中,其它雜菌被抑制,而沙門(mén)氏桿菌則能自由繁殖。又如,分離布魯氏桿菌、胎兒彎曲桿菌、炭疽桿菌、副結核桿菌可用選擇性抗菌瓊脂。分離鏈球菌和豬丹毒桿菌用疊氮鈉結晶紫血瓊脂等。如果從腸道內容物或從污染有不產(chǎn)生芽胞的雜菌培養物中分離能形成芽胞的細菌(如魏氏梭菌、破傷風(fēng)梭菌等),可將病料在80℃加熱15分鐘,以殺死不形成芽胞的雜菌,取此材料再接種培養基,即容易獲得純培養物。有些病料(如奶、尿等)含菌太少,則應先作集菌處理,然后接種,以提高檢出率,其集菌方法有離心法和過(guò)濾法。離心法取沉淀物作培養物;過(guò)濾后取沉積于濾板上表面的病料作培養。還有些細菌往往在細胞漿內集結成團,在它們所形成的病灶中含菌較少,遇到這種情況,可將病料組織磨碎,制成乳劑,加入酶、酸或堿,消化組織,使菌團散開(kāi),然后離心,收集沉淀物作培養(如從腸粘膜分離副結核桿菌即用此法)。


(三) 細菌的分離與接種 培養細菌時(shí),須將標本或細菌培養物接種于培養基上,常用接種方法有以下幾種。


1. 平板劃線(xiàn)接種法 本法為最常用的分離培養細菌的方法,通過(guò)平板劃線(xiàn)后,可使細菌分散生長(cháng),形成單個(gè)菌落,有利于從含有多種細菌的標本中分離出目的菌。分離培養用的平板培養基應表面干燥,可于臨用前置37℃孵育箱內30分鐘,這樣表面即干燥有利于分離培養,又使培養基預溫,對培養某些較嬌弱的細菌有利。常用的平板劃線(xiàn)接種法有以下幾種。


(1) 分區劃線(xiàn)法 此法多用于膿汁、糞便等含菌量較多的標本的分離。其方法是首先將接種環(huán)滅菌后,沾取標本均勻涂布于平板培養基邊緣一小部分(第一區),將接種環(huán)火焰滅菌,待冷卻后只通過(guò)第一區3-4次后連續劃線(xiàn)(為第二區),依次可共劃線(xiàn)3-5區,每一區細菌數可逐漸減少,直到分離出單個(gè)菌落為止。


(2) 連續劃線(xiàn)法 該法多用于含菌數量較少的標本。其方法是首先用白金耳將標本均勻涂布于平板培養基邊緣一小部分,然后由此開(kāi)始,在培養基表面自左向右連續劃線(xiàn)并逐漸向下移動(dòng),直到下邊緣。


劃線(xiàn)接種時(shí),盡可能作到直、密、勻,有效地利用培養基表面達到充分分離的目的。如果標本含菌較多,接種在強選擇培養基(如SS瓊脂)上時(shí)或標本含菌較少時(shí),采用分區劃線(xiàn)法接種,接種環(huán)可一直劃完各區皿內,中間不必滅菌。


2. 斜面接種法 采用該法目的是進(jìn)行純培養。其方法是從平板分離培養物上用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落或者是取純種,移種至斜面培養基上,先從斜面底部自下而上劃一條直線(xiàn),再從底部開(kāi)始向上劃曲線(xiàn)接種,盡可能密而勻,或者直接自下而上劃曲線(xiàn)接種。


3. 傾注培養法 此法適用于乳汁和尿液等液體標本的細菌計數。其方法是取原標本或經(jīng)適當稀釋?zhuān)ㄒ话闶?0-1 -10-5倍稀釋?zhuān)┑臉吮?ml,置于直徑9cm無(wú)菌平皿內,傾入已融化并冷至50℃左右的培養基約15ml,立即混勻待凝固后倒置于37℃培養18-24小時(shí),做菌落計數。


4. 穿刺接種法 本法多用于雙糖、明膠等具有高層的培養基進(jìn)行接種。方法是用接種針挑取菌落或培養物,由培養基中央直刺到距管底約0.3-0.5cm處。然后沿穿刺線(xiàn)退出接種針,若為雙糖等含高層斜面的培養基則光穿刺高層部分,退出接種針后直接曲線(xiàn)接種斜面部分。


5. 液體接種法 本法多用于普通肉湯,蛋白胨、水等液體培養基的接種。其方法是接種環(huán)沾取菌種,傾斜液體培養基管,先在液面與管壁交界處研磨接種物(以試管直立后液體能淹沒(méi)接種物為準),然后再在液體中擺動(dòng)2-3次接種環(huán),塞好棉塞后輕輕混合即可。


(四) 細菌的培養方法 根據培養細菌的目的和培養物的特性培養方法分為一般培養法、二氧化碳培養法和厭氧培養法三種。


1. 一般培養法 將已接種過(guò)的培養基,置37℃培養箱內18-24小時(shí),需氧菌和兼性厭氧菌即可于培養基上生長(cháng)。少數生長(cháng)緩慢的細菌,需培養3-7天直至一個(gè)月才能生長(cháng)。為使培養箱內保持一定濕度,可在其內放置一杯水。培養時(shí)間較長(cháng)的培養基,接種后應將試管口塞棉塞后用石臘凡士林封固,以防培養基干裂。


2. 二氧化碳培養法 某些細菌,如牛流產(chǎn)布氏桿菌和胎兒弧菌等需要在含有10%二氧化碳的空氣中才能生長(cháng),尤其是初代分離培養要求更為嚴格。將已接種的培養基置于二氧化碳環(huán)境中進(jìn)行培養的方法即二氧化碳培養法,常用方法有以下幾種:


(1) 二氧化碳培養箱 可將已接種的培養基直接放入箱內孵育,即可獲得二氧化碳環(huán)境。


(2) 燭缸法 將已接種的培養基,置于容量為2 000ml的磨口標本缸或干燥器內。缸蓋或缸口處均需涂以凡士林,然后點(diǎn)燃蠟燭直立置入缸中,密封缸蓋。待燃自行熄滅時(shí),容器內約含5-10%的CO2 容器置37℃培養。


(3) 重碳酸鈉-鹽酸法 每升容積的容器內,重碳酸鈉與鹽酸按0.4g與3.5ml的比例,分別將兩種藥各置一器皿內(如平皿內),連同器皿置于標本缸或干燥器內,蓋嚴后使容器傾斜,兩種藥品接觸后即可產(chǎn)生二氧化碳。


3. 厭氧培養法 目前常用的厭氧培養方法有厭氧罐法、氣袋法及厭氧箱三種。


(1) 厭氧罐法 是目前應用較廣泛的一種方法,共分為以下幾種。


抽氣換氣法:該法適用于一般實(shí)驗室,其特點(diǎn)是較經(jīng)濟并可迅速建立厭氧環(huán)境。標本接種后,將平板放入厭氧罐,擰緊蓋子,用真空泵抽出罐中空氣,使壓力真空表至-79.98KPa,停止抽氣,充入高純氮氣使壓力真空表指針回0位,連續反復3次,最后在罐內-79.98KPa的情況下,充入70%的N2 、20%H2 、10%CO2 (有人改用20%CO2 及80%H2 ,亦可獲得好結果)。罐中需放入冷催化劑鈀粒,可催化罐中殘余的O2 和H2 化合成水。同時(shí)罐中應放有美藍指示管,美藍在有氧的環(huán)境下呈藍色,無(wú)氧時(shí)為紅色。臨用前首先將美藍煮沸使變成無(wú)色,放入罐中先呈淺藍色,待罐中無(wú)氧環(huán)境形成,美藍即可持續無(wú)色。


氣體發(fā)生袋法:氣體發(fā)生袋系由錫箔密封包裝,其中含有兩種藥片,一種為含枸椽酸和重碳酸氫鈉的藥片,另一種是含有硼氫化鈉的藥片。前者遇水放出二氧化碳,后者可釋放氫。使用時(shí)在袋的右上角剪一小口,灌進(jìn)10ml蒸餾水,立即放入含有鈀粒、指示劑及平板培養基的厭氧罐中,擰緊蓋子經(jīng)2-3分鐘后,可感到蓋子微熱并有少量水蒸氣出現。密封后1小時(shí)左右罐中的O2 的含量可低于<1%。


(2) 氣袋法 此種方法不需要特殊設備,操作簡(jiǎn)單,使用方便,不但實(shí)驗室中可用,而且外出采樣、現場(chǎng)接種也可用。原理與氣體發(fā)生袋完全相同,只是采用塑料袋代替了厭氧罐,氣袋為一透明而密閉的塑料袋,內裝有氣體發(fā)生安瓿、指示劑安瓿、含有催化劑的帶孔塑料管各一支。其操作方法為首先將接種的平板培養基放入袋中,用彈簧夾夾緊袋口,然后用手指壓碎氣體安瓿,20分鐘后再壓碎指示劑安瓿,如果指示劑不變藍色,說(shuō)明袋內達到厭氧狀態(tài),即可放入37℃進(jìn)行培養。


(3) 厭氧培養箱 使用之前須仔細檢查厭氧裝備有無(wú)漏氣等問(wèn)題,以及催化劑、指示劑質(zhì)量等。使用時(shí)嚴格遵守操作規程,保證箱內氣體比例合理。




細胞培養常見(jiàn)問(wèn)題及其解決


1. 如何選用特殊細胞系培養基?




培養某一類(lèi)型細胞沒(méi)有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(cháng)??傊?,首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個(gè)好的開(kāi)始。


2. 何時(shí)須更換培養基?


視細胞生長(cháng)密度而定, 或遵照細胞株基本數據上之更換時(shí)間,按時(shí)更換培養基即可。


3. 可否使用與原先培養條件不同之培養基?


不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基,若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基, 細胞大都無(wú)法立即適應, 造成細胞無(wú)法存活。


4 可否使用與原先培養條件不同之血清種類(lèi)?


不能。血清是細胞培養上一個(gè)極為重要的營(yíng)養來(lái)源,所以血清的種類(lèi)和品質(zhì)對于細胞的生長(cháng)會(huì )產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清,在一些物質(zhì)或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會(huì )造成細胞無(wú)法存活。


5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?


FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯誤的使用字眼, 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。


6 培養細胞時(shí)應使用5 % 或10% CO2?或根本沒(méi)有影響?


一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統, 而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時(shí)應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí),細胞培養時(shí)應使用10 % CO2;當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí), 則應使用5 % CO2 培養細胞。


7.Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養箱。原因是什么?Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別?


HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會(huì )變堿,Hanks液在CO2培養箱中會(huì )變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。


8. 細胞之接種密度為何?


依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤(pán)之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無(wú)法生長(cháng)之一重要原因。


9. 懸浮性細胞應如何繼代處理?


一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中, 稀釋細胞濃度即可,若培養液太多時(shí), 可將培養角瓶口端稍微抬高, 直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶, 加入新鮮培養基稀釋至適當濃度, 重復前述步驟即可。


10.冷凍管應如何解凍?


取出冷凍管后, 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍, 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化, 并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿,否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí), 必須注意安全, 預防冷凍管之爆裂。


11. 細胞冷凍管解凍培養時(shí), 是否應馬上去除DMSO?


除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外, 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞), 在解凍之后, 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中,待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解凍后細胞無(wú)法生長(cháng)或貼附之問(wèn)題。


12. 附著(zhù)性細胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?


一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開(kāi)瓶后應立即少量分裝于無(wú)菌試管中,保存于–20 °C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低,并可減少污染之機會(huì )。


13.欲將一般動(dòng)物細胞離心下來(lái),其離心速率應為多少轉速?


欲回收動(dòng)物細胞, 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),5 - 10 分鐘, 過(guò)高之轉速, 將造成細胞死亡。


14. 細胞冷凍培養基之成份為何?


動(dòng)物細胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來(lái)細胞生長(cháng)用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì )放出大量熱能, 故不可將DMSO 直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。


15.DMSO 之等級和無(wú)菌過(guò)濾之方式為何?


冷凍保存使用之DMSO 等級, 必須為T(mén)issue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即為無(wú)菌狀況, 第一次開(kāi)瓶后應立即少量分裝于無(wú)菌試管中, 保存于4°C,避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì), 并可減少污染之機會(huì )。若要過(guò)濾DMSO, 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。


16.冷凍保存細胞之方法?


冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長(cháng)期儲存。


冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase長(cháng)期儲存。*-20 °C 不可超過(guò)1 小時(shí), 以防止冰晶過(guò)大,造成細胞大量死亡,亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。


17. 細胞欲冷凍保存時(shí), 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?


冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。


18.培養基中是否須添加抗生素?


除于特殊篩選系統中外, 一般正常培養狀態(tài)下, 培養基中不應添加任何抗生素。


19.應如何避免細胞污染?


細胞污染的種類(lèi)可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無(wú)菌操作技術(shù)不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來(lái)源和培養基配制是減低污染之最好方法。


20.如果細胞發(fā)生微生物污染時(shí),應如何處理?


原則上:直接滅菌后丟棄之。


當重要的培養污染時(shí),研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開(kāi),用實(shí)驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺,檢查HEPA過(guò)濾器。

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實(shí)驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂(lè )菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實(shí)驗步驟。


1.在無(wú)抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞,稀釋到常規細胞傳代的濃度。


2.分散細胞懸液到多孔培養板中,或幾個(gè)小培養瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內,把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。


3.每天觀(guān)測細胞毒性指標,如脫落,出現空泡,匯合度下降和變圓。


4.確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2~3代。


5.在無(wú)抗生素的培養基中培養細胞一代。


6.重復步驟4。


7.在無(wú)抗生素的培養基中培養4~6代,確定污染是否以已被消除。


21.支原體(mycoplasma) 污染的細胞,是否能以肉眼觀(guān)察出異狀?


不能。除極有經(jīng)驗之專(zhuān)家外,大多數遭受支原體污染的細胞株,無(wú)法以其外觀(guān)分辨之。


22.支原體污染會(huì )對細胞培養有何影響?


支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長(cháng)參數, 代謝及研究之任一數據。故進(jìn)行實(shí)驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實(shí)驗結果之數據方有意義。


23. 偵測出細胞株有支原體污染時(shí), 該如何處理?


直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。


24. CO2 培養箱之水盤(pán)如何保持清潔?


定期(至少每?jì)芍芤淮? 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去

在線(xiàn)客服
聯(lián)系方式

熱線(xiàn)電話(huà)

4009937078

上班時(shí)間

周一到周日

公司電話(huà)

15093251886

二維碼
線(xiàn)