血漿凝固酶試驗操作步驟

【原理】
病原性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，附于細菌表面，生成凝塊，因而具有抗吞噬的作用。凝固酶試驗對于判定該菌株是否具有致病力，很有幫助。葡萄球菌凝固酶試驗被廣泛地用于常規(guī)鑒定金黃色葡萄球菌與其他葡萄球菌。

葡萄球菌所產(chǎn)生的凝固酶有兩種：結(jié)合凝固酶和游離凝固酶。

結(jié)合凝固酶（即凝聚因子）：是一種結(jié)合于菌體細胞壁的酶，它直接作用于血漿中纖維蛋白原，使之變成纖維蛋白，而使葡萄球菌凝集成塊，玻片法陽性結(jié)果是由此酶（凝聚因子）所致。

游離凝固酶：是凝血酶原樣物質(zhì)，不直接作用于血漿纖維蛋白原上，而被血漿中的致活劑（即凝固酶致活因子）激活后，變成耐熱的凝血酶樣物質(zhì)，此物質(zhì)可使血漿中的液態(tài)纖維蛋白原變?yōu)楣虘B(tài)纖維蛋白，從而使血漿凝固。試管法的陽性結(jié)果為此酶所致。

【方法】
（1）玻片法：在1張潔凈玻片中央加1滴9g／L氯化鈉(生理鹽水)溶液，用接種環(huán)取待檢培養(yǎng)物與其混合（設陽性和陰性對照）制成菌懸液，若經(jīng)10～20s內(nèi)無自凝現(xiàn)象發(fā)生，則加入兔新鮮血漿1環(huán)，與菌懸液混合，觀察結(jié)果。
（2）試管法：用生理鹽水將新鮮兔血漿4倍稀釋，取0．5ml于試管再加0.5ml待測菌濃菌懸液（需做陽性對照及陰性對照。），混勻后置37℃水浴中，每30min觀察1次結(jié)果。若3小時內(nèi)試驗管和陽性對照管出現(xiàn)凝固，陰性對照管（即濃菌液管）不凝固，為陽性；若陰性，繼續(xù)觀察到24小時，不凝固者為陰性。

【結(jié)果判斷】
（1）玻片法：5～10s內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性。
（2）試管法：如有凝塊或整管凝集出現(xiàn)為陽性。4h后無上述現(xiàn)象出現(xiàn)，則放置過夜后再觀察。

【應用】
本試驗僅用于致病性葡萄球菌的鑒定。

【注意事項】
（1）玻片法：10秒內(nèi)觀察結(jié)果，如超過10?秒可出現(xiàn)假陽性，因此必須用試管法驗證凝聚因子試驗。

（2）可選擇的玻片凝集試驗法還包括檢測凝集因子和蛋白A的膠乳凝集試驗。但膠乳凝集試驗和玻片凝固酶試驗的結(jié)果并不完全一致。盡管膠乳凝集試驗鑒定路鄧葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis）的可靠性較差，但鑒定金黃色葡萄球菌的特異性和靈敏性均高于傳統(tǒng)的玻片凝固酶試驗。有些腐生葡萄球菌和松鼠葡萄球菌及某些微球菌屬的菌種可能膠乳凝集試驗陽性，但玻片凝固酶試驗通常陰性。

（3）試管法：須制備濃厚的均勻菌懸液，以便觀察結(jié)果。
a.試管法葡萄球菌凝固酶試驗陽性者，應見到明顯的纖維蛋白凝膠塊，出現(xiàn)羊毛狀或纖維狀沉淀物并非真正凝固，應判為陰性。中間型葡萄球菌、豬葡萄球菌需要較長時間（4H以上）孵育，才可出現(xiàn)陽性。
b.如果培養(yǎng)時間超過4H，應考慮以下幾點：
Ⅰ.延長培養(yǎng)時間后，有些菌株產(chǎn)生的葡萄球菌激酶（溶纖維蛋白酶），可以裂解凝塊，產(chǎn)生假陰性結(jié)果；
Ⅱ.如果使用的血漿不是無菌的（或部分不是無菌的），假陽性和假陰性結(jié)果均有可能發(fā)生；
Ⅲ.所用待測菌不純，延長培養(yǎng)時間后，污染菌可能導致假陽性結(jié)果。在這點上，含EDTA的血漿優(yōu)于檸檬酸鹽血漿，因為利用檸檬酸鹽的細菌（如一些鏈球菌）可能通過消耗檸檬酸鹽促進凝集發(fā)生。
Ⅳ.所用血漿缺乏纖維蛋白原（脫纖維血漿）。

（4）最好用EDTA抗凝的兔血漿，不主張用人的抗凝血，除非經(jīng)過試驗證實其中不含感染因子、沒有凝血能力和沒有抑制因子。不同種動物血漿因子不同，凝固狀態(tài)也不同，兔血漿凝塊結(jié)實，凝固速度快，優(yōu)于人血漿。

（5）試驗不可在高鹽培養(yǎng)基上的取菌落，因為可能出現(xiàn)自凝或假陽性。

（6）若被檢菌為陳舊的肉湯培養(yǎng)物（超過18～24H），或生長不良，凝固酶活性低的菌株可能檢測不出來。

(7)為防止玻片法檢測的假陽性反應，必須嚴格按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行操作。當懷疑待測菌是金黃色葡萄球菌時，對玻片凝固酶陰性的結(jié)果應做試管法凝固酶試驗確證。玻片法和試管法凝固酶試驗的血漿標準是:必須含有足夠濃度的凝固酶反應因子和纖維蛋白原，必須無溶纖維蛋白活性和無抑制劑。

附：
1.玻片法檢測血漿凝固酶陽性的菌有：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、里昂葡萄球菌（即：路鄧葡萄球菌Staphylococcus lugdunensis）、施氏葡萄球菌凝聚亞種（Staphylococcusschleiferi ssp. coagulans）及部份中間型葡萄球菌（staphylococcusintermedius）。

2.試管法檢測血漿凝固酶陽性的菌有：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、施氏葡萄球菌凝聚亞種（Staphylococcusschleiferi ssp. coagulans）、中間型葡萄球菌（staphylococcusintermedius）、海豚葡萄球菌(Staphylococusdelphini)及部份豬葡萄球菌（staphylococcushyicus)。

3.我做的試管法試驗圖：
左：測定管(陰性)，右：標準金葡菌株(陽性)

4.關于路鄧葡萄球菌Staphylococcus ?lugdunensis）：菌落直徑常為4～7MM，平滑，有光澤，可能無色素沉著或呈現(xiàn)奶油色至橘黃色。邊緣完整，相當扁平，中心呈輕微圓錐狀凸起。玻片凝固酶試驗（+）?？煞纸夂Ｔ逄?、甘露糖、麥芽糖、蔗糖且產(chǎn)酸，不分解甘露醇且不產(chǎn)酸。PYR（pyrrolidonase：吡咯烷酮基芳胺酶）(+)、ODC（+）（培養(yǎng)8H觀察，此時表皮葡萄球菌為陰性。）。

5.關于施氏葡萄球菌（Staphylococcus schleiferi ssp.）：菌落直徑常為3～5MM且無色素沉著，光滑有光澤，輕微凸起，邊緣完整。玻片凝固酶試驗（+）。PYR（pyrrolidonase：吡咯烷酮基芳胺酶）(+)?？煞纸飧事短?，有時也分解海藻糖而產(chǎn)酸，但不分解甘露醇、麥芽糖或蔗糖。